Presso la Collezione DBVPG sono periodicamente tenuti Corsi di formazione teorico-pratici su argomenti inerenti alla biologia, alla tassonomia (convenzionale e molecolare) e alla biotecnologia dei lieviti.

Schema generale di Corso di formazione sull’isolamento, coltivazione identificazione & conservazione di ceppi di lievito (durata 5 giorni)

GIORNO 1

Tecniche di isolamento di ceppi di lieviti da ambienti naturali o industriali:

• preparazione dei terreni di coltura per l’isolamento dei lieviti (es. Rose Bengal agar; DG18; DRBC)
• campionamento in sterilità di differenti substrati: materiale vegetale, suolo, alimenti, ghiaccio, acqua, ecc.
• decontaminazione post-campionamento, se necessario (utilizzando tecniche meccaniche o chimico-fisiche)
• colture di arricchimento dei campioni, se necessario (uso di specifici terreni di coltura liquidi per incrementare la presenza di lieviti)
• uso di specifici tamponi o tensioattivi per la rimozione delle cellule di lievito dai campioni
• filtrazione o diluizioni seriali dei campioni allo scopo di ottenere colonie isolate
• selezione di specifiche condizioni di crescita
• procedure di isolamento in piastre Petri (es. strisciamento su piastra)

GIORNO 2

Identificazione e caratterizzazione di colture di lieviti tramite metodi convenzionali:

• osservazione delle caratteristiche macromorfologiche (colore, forma, elevazione, margine, ecc.) di differenti colonie di lieviti su differenti terreni di coltura (YPD, PDA, YMA, MEA, CMA)
• osservazione della morfologia cellulare di differenti specie di lieviti (forma, grandezza, riproduzione sessuale/asessuale, formazione di pseudomicelio/micelio, presenza di spore, ecc…)
• determinazione del profilo di assimilazione con kit commerciali (ID32C o YT MicroPlate Biolog)
• determinazione del profilo fisiologico utilizzando test addizionali (DBB, urea test, produzione di amido, temperatura ottimale, sviluppo ad elevate percentuali di glucosio e NaCl, fermentazione delle principali fonti di carbonio e azoto)
• preparazione dei terreni di coltura, inoculo, incubazione, lettura ed interpretazione dei risultati

GIORNO 3

Identificazione di colture di lievito utilizzando metodi molecolari:

• estrazione di DNA da colture pure di lievito utilizzando metodi correnti
• controllo della presenza di DNA estratto mediante elettroforesi in gel di agarosio
• reazione PCR per l’amplificazione di specifiche porzioni di DNA [dominio D1/D2 del gene rRNA 26S (LSU) e Internal Transcribed Spacers (ITS1&2) comprendente il gene rRNA 5.8S]
• controllo dell’amplificazione mediante elettroforesi in gel di agarosio
• purificazione e quantificazione degli amplificati
• allineamento delle sequenze nucleotidiche ottenute utilizzando SeqmanTM II e MegAlignTM (gli allineamenti saranno controllati e corretti manualmente) e identificazione a livello di specie mediante confronto delle sequenze ottenute con il database GenBank (BLASTN freeware from www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

GIORNO 4

Conservazione delle colture di lievito:

• trasferimento periodico su agar (metodo di conservazione di colture metabolicamente attive): preparazione di slants di specifici terreni di coltura (YPD e PDA) ed inoculo di differenti ceppi; conservazione
• conservazione per disidratazione sotto vuoto (in forma liofilizzata): preparazione dei terreni di coltura e delle cellule, sterilizzazione delle vials, ottenimento della sospensione congelamento, liofilizzazione e conservazione
• conservazione dei lieviti tramite congelamento e permanenza a bassa temperatura (-80°C) su supporti di ceramica (preparazione dei supporti e delle vials, preparazione del terreno, preparazione della sospensione cellulare per il congelamento, distribuzione della sospensione, congelamento e conservazione)
• rivitalizzazione dei ceppi conservati nelle forme sopra riportate
• controllo di qualità periodico di purezza e vitalità delle colture dopo rivitalizzazione (osservazione macroscopica e microscopica)

GIORNO 5

Screening di lieviti per la selezione di ceppi di interesse industriale:

• preparazione di terreni di coltura specifici per le attività da ricercare: capacità fermentativa (metodi qualitativi e quantitativi); capacità di sviluppare a concentrazioni crescenti di NaCl e carboidrati; produzione di composti anti-lievito (es. proteine killer) su piastra Petri, determinazione semi-quantitativa su piastra Petri di attività enzimatiche extracellulari (amilasi, esterasi, lipasi, proteasi, pectinasi)
• inoculo dei ceppi
• lettura ed interpretazione dei risultati

Gestione di una Collezione di colture microbiche. Linee guida e modulistica per:

• deposito di nuovi ceppi
• controllo degli stock
• invio di colture
• deposito di ceppi brevettati